Автореферат диссертации по медицине на тему Фармакогенетический анализ феномена стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции
На правах рукописи
005048077
ЯРКОВА МИЛАДА АЛЬНОРДОВНА
ФАРМАКОГЕИЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФЕНОМЕНА СТРЕССИНДУЦИРОВАННОГО ПАДЕНИЯ БЕНЗОДИАЗЕПИНОВОЙ
РЕЦЕПЦИИ
14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
1 0 п'пВ 2013
Москва - 2012
005048077
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В.Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН)
Научный консультант:
доктор медицинских наук,
профессор, академик РАН и РАМН Ссрсденнн Сергей Борисович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, зав. кафедрой молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И.Пирогова Минздрава России
Шимановский Николай Львович
доктор медицинских наук, профессор,
главный научный сотрудник лаборатории психофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии
имени В.В.Закусова» РАМН Островская Рита Ушеровна
доктор биологических наук, профессор,
зав. кафедрой физиологии человека и животных Биологического факультета
МГУ им. М.В.Ломоносова Каменский Андрей Александрович
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Московский государственный меднко-стоматологическнй университет имени А.И.Евдокнмова» Минздрава России
Защита состоится « года в часов на заседании
диссертационного совета Д.001.024.01, созданного на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН по адресу: 125315, Россия, г. Москва, ул. Балтийская, 8.
Автореферат разослан »
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор
Вальдман Елена Артуровна
Актуальность исследования. Со времени введения Vogel в 1957 г. термина «фармакогенетика» и публикации первых монографий по проблеме [Ralow W. 1962; Motulsky AG. 1964] основной задачей нового направления пауки является поиск наследственных характеристик фенотипа состояния. подлежащего фармакологической коррекции и систем, опосредующих фармакокинетику и фармакодинамику применяемого лекарства у данного индивидуума. Если для многих моногенно контролируемых заболеваний или лекарственных эффектов задача решена либо близка к решению, то при мультифакториальном наследовании, несмотря на чрезвычайно большое число исследований, однозначных результатов не получено [Середенин С.Б., 2004]. Развернутые после расшифровки генома человека работы по фармакогеномике выявили ряд ассоциаций, не превышающих, однако, 60-70%, что ограничивает использование полученных данных для персонифицированной медицины. Поэтому в современной фармакогенетике наиболее важным остается поиск интегральных фенотипических показателей, основанных на понимании патогенеза заболевания и механизма действия препарата [Середенин С.Б., 2004: Kalow W. et al., 2005; Porcelli S et al„ 2011]. Задача актуальна как для клинической, так и для экспериментальной фармакологии. В последнем случае обнаружение фармакодинамических маркеров ведет к выявлению новых фармакологических мишеней, что, в свою очередь, создает основу для разработки новых оригинальных лекарственных средств.
Состояния тревоги в современных системах классификации рассматриваются в качестве, как самостоятельных нозологических единиц, так и коморбндных большому числу соматических заболеваний. На сегодняшний день фармакотерапия тревожных расстройств далека от совершенства, поскольку, основные фармакотерапевтические средства - бензодиазепнновые транквилизаторы и препараты, влияющие на серотонинергическую передачу, имеют с, одной стороны, целый ряд недостатков, обусловленных побочными действиями, длительностью наступления эффекта и пр., а с другой - требуют учета индивидуальной чувствительности, методы объективной оценки которой не разработаны. Поэтому, актуальным остается поиск новых анксиолитиков реализующих свой эффект через разные мишени, что требует дальнейшего изучения центральных механизмов формирования тревоги и реакции страха.
Наиболее важной нейрохимической структурой, регулирующей процессы торможения, является ГАМКд рецептор: белковый комплекс осуществляющий транспорт ионов СГ в клетку, в состав которого в разных сочетаниях могут входить до 19 субъединиц [Rudolph U, Knoflach F., 2011]. ГАМКд рецептор опосредует
влияние многих фармакологических препаратов с анксиолитическими, седативными, снотворными, противосудорожными, а также анксиогенными и просудорожными свойствами. Наибольшее распространение получили бензодиазепиновые транквилизаторы, усиливающие при специфическом связывании с ГАМКд рецептором ГАМК трансмиссию.
Почти одновременно с открытием бензодиазепинового участка ГАМКа рецептора [Mhler Н, Okada Т. 1977; Squires RF, Braestrup С. 1977] были получены экспериментальные результаты, демонстрирующие изменения его связывающей способности при стрессовых воздействиях [Lippa AS et al, 1978; Braestrup С. et al., 1979]. В последние годы появились отдельные клинические исследования, подтверждающие данный феномен методами нейровизуализации [Bremner JD., 2004; Holzschneider К, Mulert С., 2011]. Однако, систематического фармакологического изучения стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции не проводилось. Прежде всего, весьма противоречивы данные о генетической зависимости феномена [Beizung С., 2001; Skilbeck KJ, Johnston GA, Hinton Т., 2010]. Не ясно, при каких видах стрессовых воздействий снижение рецепции бензодиазепинов возникает. Какова выраженность и продолжительность сдвигов. Открытым остается вопрос о значимости феномена в формировании эффекта анксиолитиков разных химических структур и механизмов действия, для соединений с анксиогенными свойствами.
Для решения этих проблем предпринято комплексное экспериментально-фармакогенетическое изучение связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора.
Цель работы. Определение значения феномена падения связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора для характеристики состояния тревоги и эффектов фармакологических препаратов с анксиолитическими и анксигенными свойствами.
Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Оценить связывающую способность бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора у инбредных животных с активной стратегией поведения - мышей С57В1/6, крыс MNRA и реакцией замирания - мышей Balb/c, крыс MR, в тесте «открытое поле».
2. Исследовать изменения бензодиазепиновой рецепции у инбредных мышей С57В1/6 и Balb/c при эмоционально-стрессовом воздействии в тестах «приподнятый крестообразный лабиринт», иммобилизация, «контакт с хищником», вынужденного плавания, «горячая пластинка».
3. Установить продолжительность падения бензодиазепиновой рецепции у мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с после экспериментов в тестах «открытое поле» и «контакт с хищником».
4. На экспериментальных моделях тревоги исследовать влияние на бензодиазепиновую рецепцию препаратов афобазол, М-11, ладастен, ноопент, ГБ-115 и диазеиам.
5. Изучить влияние на бензодиазепиновую рецепцию фармакологических препаратов с анксиогенными свойствами.
6. Выполнить фармакологические исследования по выявлению анксиолитической активности у препаратов, предотвращавших падение бензодиазепиновой рецепции при эмоционально-стрессовых воздействиях.
7. Оценить изменения бензодиазепиновый рецепции у беспородных мышей, разделенных по признакам поведения в тесте «открытое поле» на субпопуляции с активной стратегией поведения и с реакцией замирания.
8. Исследовать изменения бензодиазепиновой рецепции у выделенных субпопуляцин беспородных мышей при эмоционально-стрессовом воздействии в тестах «приподнятый крестообразный лабиринт» и «контакт с хищником».
9. Оценить на беспородных мышах выделенных субпопуляций влияние фармакологических препаратов с анксиолитическими свойствами.
Научная новнзна. Впервые проведен комплексный анализ стрессиндуцированных нарушений бензодиазепиновой рецепции на инбредных и беспородных животных с разным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Доказана генетически обусловленная зависимость сопряженного с тревогой падения бензодиазепиновой рецепции от силы стресснрующего фактора.
Впервые установлено, что временные характеристики стрессиндуцированного снижения беизодиазепинового связывания специфичны для генотипа.
Экспериментально показано, что соединения с анксиогенными свойствами вызывают падение бензодиазепиновой рецепции.
Впервые выявлено, что иротивотревожная активность препаратов афобазол, МИ, ноопент, ладастен и соединения ГБ-115 с различной химической структурой и механизмами действия связана с нормализацией уровня бензодиазепиновой рецепции, нарушенной стрессирующими факторами.
Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о феномене падения бензодиазепиновой рецепции как нейрохимическом маркере состояний тревоги и эффектов анксиолитиков.
Разработан метод разделения беспородной популяции мышей на высоко- и низкотревожные субпопуляции с объективизацией типирования по стрессиндуцированному падению бензодиазепинового связывания.
На беспородных субпопуляциях мышей с разным фенотипом стрессового ответа полностью подтверждены результаты, полученные на инбредных животных, демонстрирующие изменения бензодиазепиновой рецепции при стрессовых воздействиях и при введении анксиолитиков, что позволяет сделать заключение о маркерной значимости данного феномена для характеристики тревожных состояний и их фармакологической коррекции.
Научно-практическая значимость. Доказательство маркерного значения феномена стрессиндуцированного падения бензодиазепиновой рецепции явилось основой для методических рекомендаций по новым экспериментальным моделям состояний тревоги и доклиническому изучению эффектов анксиолитиков.
На основе сформулированной и экспериментально подтвержденной гипотезы о феномене падения бензодиазепиновой рецепции как маркере состояния тревоги и фармакологической мишени анксиолитиков разработаны и внедрены в медицинскую практику лекарственные препараты афобазол и ладастен. Установленные данные об анксиолитических свойствах препарата ноопепт вошли в досье при регистрации препарата в Минздрасоцразвия РФ. Данные по препарату ГБ-115 включены в регистрационное досье для получения разрешения на клинические исследования.
Материалы диссертации использованы в учебном лекционном курсе по фармакогенетике для студентов ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова, Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова, Сибирского государственного медицинского университета.
На основании экспериментальных данных получены Патенты РФ №2061686 от 10.06.1996, №2175229 от 27.10. 2001, №2261709 от 10.10.2005, № 2373202 от 27.04.2009.
Предложен новый метод разделения беспородной популяции лабораторных животных по фенотипу стрессового ответа. Выявленные закономерности изменения рецепции в бензодиазепиновом сайте ГАМКа рецептора перспективны для разработки в клинике способов диагностики тревожных состояний и оценки действия анксиолитиков методами нейровизуализации.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Формирование реакции страха при эмоционально-стрессовых воздействиях сопряжено со снижением связывающей способности в бензодиазепиновом участке ГАМКа рецептора
2. Наследственные различия в стрессиндуцированном падении связывания бензодиазепинов зависят от силы стрессирующего фактора и характеризуются разным периодом восстановления рецепции
3. Фармакологические препараты с анксиогенными свойствами вызывают, а анксиолитики предотвращают стрессиндуцированное падение бензодиазепиновой рецепции
4. У беспородных мышей, разделенных по типу поведения в тесте «открытое поле» на высоко- и низкотревожных в физиологических и фармакологических экспериме нтах подтверждены закономерности изменений бензодиазепиновой рецепции, установленные на инбредных животных с различным фенотипом ответа на эмоциональный стресс
5. Изменения бензодиазепиновой рецепции могут быть использованы в качестве нейрохимического маркера состояния тревоги и эффекта анксиолитиков
ЛнчныП вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования. На основе сформулированной гипотезы о феномене падения бензодиазепиновой рецепции как нейрохимическом маркере состояний тревоги и эффектов анксиолитиков автором самостоятельно разработаны методические подходы, протоколы исследований. Автор принимал непосредственное участие в выполнении экспериментов, анализировал и осуществлял статистическую обработку полученных результатов, нх обобщение и подготовку публикаций.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на международных конференциях: 5th ECNP Regional Meeting, Санкт-Петербург, 2000 г.; 3-ей, 4-ой и 5-ой Международной научной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Россия. 2001, 2006 и 2010 гг.; II, III и IV Съезде Российского Научного общества фармакологов 2003, 2007 и 2012 гг.; 14-ом, 15-ом и 16-ом Всемирном конгрессе фармакологов, Сан-Франциско, 2002 г., Пекин, 2006 г. и Копенгаген, 2010 г.; 8th ECNP Regional Meeting, Москва, 2005; Международной научной конференции «Лекарственные средства и биологически активные соединения», Гродно, 2007 г.; VIth ежегодной международной конференции «Pharmacogenetics in Psychiatry», Нью-Йорк, 2007; XXVII Congress of the CINP, Гонконг, 2010 г.; 28lh CINP World congress of Neuropsychopharmacology, Стокгольм, 2012.
Работа апробирована на заседании межлабораторной конференции ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН (протокол № 3 ог 18.10.2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 59 печатных работ. Основное содержание диссертации отражено в 16 статьях в ведущих рецензируемых
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 317 страницах, содержит 53 таблицы и 43 рисунка и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (главы 3-6), заключения, выводов и списка литературы, включающего 802 источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследовании использованы мыши-самцы инбредных линий Balb/c и С57В1/6 массой 19-25 г, крысы-самцы инбредных линий Maudsley Reactive (MR) и Maudsley Non-reactive (MNRA) массой 200-250 г, беспородные мыши-самцы линии CD-I массой 19-25 г. (питомники РАМН и РАН). Животные содержались в условиях лабораторного вивария в контролируемых условиях окружающей среды (20-22°С и 30-70% относительная влажность, 12-часовой цикл освещения, 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час), в пластмассовых клетках с верхней крышкой из нержавеющей стали с подстилкой, обеспыленной из деревянной стружки, по 10 крыс или 20 мышей в каждой клетке, при постоянном доступе к экструдированному брикетированному корму ГОСТ Р 50258-92 [1993] и питьевой воде. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики и Приказу МЗ и CP РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики». Животные распределялись по группам рандомизированно, по критерию массы тела, с отклонением от среднего значения не более чем на ±10%. Перед опытом животных выдерживали в экспериментальной комнате в «домашних» клетках в течение 24 часов. При проведении экспериментов были приняты меры, позволяющие избежать излишних физических страданий или повреждений животных.
В работе использовали фармацевтические субстанции афобазола (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио] бензимидазола дигидрохлорид), ноопепта (этиловый эфир N-фенилацетил-1.-пролилглицина), ГБ-115 (амид К-фенилгексаноил-глицил-Ь-триптофана), микронизированную переосажденную субстанцию ладастена (N-(2-адамантил)-Ы-(парабромфеннл)амина), субстанцию МП (2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5-этокси-бензимидазола гидрохлорид). Все вещества синтезированы в ФГБУ «НИИ фармакологии имена В.В.Закусова» РАМН. Диазепам использовался в виде лекарственной формы раствора для инъекций фирмы Polfa Tarchamin S.A., содержащего в пересчете на 1 мл раствора 5 мг действующего вещества. Растворы афобазола, ноопепта, Mil и диазепама готовились в дистиллированной воде и вводились однократной внутрибрюшинпой инъекцией. Субстанции ладастена и ГБ-
115 готовились в виде суспензии с Твин-80 и дистиллированной водой и вводились однократно зондом в желудок.
В экспериментах использовались: [М-метил-3Н]-диазепам (Радиевый институт им. В.Г. Хлопина), [N-mctiiji-3! 1|-флушпразепам (Amcrsham Bioscience), TRIS-(гидроксиметил)-аминомонометан (Biosolve, Нидерланды), HCl (Реахим), нафталин (Fluka), 1,4-диоксан (ЗЛО Мосреактив), 2,5-дифенилоксазол (РРО) (Fluka), 1,4-бис-(5-фенил-2-оксазолил)-бензол (РОРОР) (Fluka), диазепам (Sigma), альбумин (Bovine, albumin, SIGMA Chemical Co), NaO (ДиаэМ, Россия), Na2C03 (ДиаэМ, Россия), CuS04 • 5H20 (ДиаэМ, Россия), натрий виннокислый (ДиаэМ, Россия), реактив Фолина (Рапгеас, Испания), кофеин (Sigma), n-Butyl--carboline-3 carboxylate (-CCB) (RBI), yohimbine hydrochloride (Acros Organics, США), стекловолоконные фильтры (GF/B,Whatman). Составы использованных стандартных растворов: сцинтилляционная жидкость (0,375 г РОРОР; 8,75 г РРО; 125 г нафталин; 1 л 1,4-диоксан); TR1S-HC1 буферный раствор (t=4°, 50мМ, рН=7,4) (6 г TRIS-(гидроксиметил)-амипомонометана; 1 л дистиллированной воды; HCl (доведение pH до 7,4).
Для моделирования различных воздействий и/или оценки изучения влияния соединений на поведение и нейрохимические эффекты у лабораторных животных применяли стандартные методы исследования, включенные в «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [ред. - Р.У.Хабрнев, 2005], в их числе: тесты «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), «открытое поле» (ОП) в модификации [Бородин П.М. с соавт., 1976]. темно-светлая камера (ТСК), «горячая пластинка» (ГП), «вынужденное плавание» (ВП).
Реакцию страха моделировали в тестах «контакт с хищником» (КХ) и «кратковременная иммобилизация» (Им) [Rodgers RJ, et al., 1997; Bhatia N. et al., 2011].
Для оценки седативных или активирующих свойств соединений вне стрессового воздействия использовали установку Optovarimex (Columbus Corp., США).
Для оценки координации и моторных функций использовали установку Rotarod компании Panlab (Испания).
Анализ рецепции в бензодиазепиновом участке ГАМКа рецептора мембранной фракции головного мозга мышей и крыс проводили радиолигандиым методом с использованием [М-метил-3Н]-диазепама (удельная активность 67,4 Ки/ммоль) и [N-метил-3Н]-флунитразепама (удельная активность 87,0 Ки/ммоль).
Мембранную фракцию головного мозга крыс выделяли по следующей схеме: после декапитации немедленно извлекали головной мозг, отделяли стволовые структуры и мозжечок. Оставшуюся часть мозга гомогенизировали в 16 мл ледяного TR1S-HC1 буферного раствора (t=0-4°, 50мМ, РН=7,4) используя гомогенизатор Ultra-turrax Т25 (IKA-labortechnik). Полученную суспензию центрифугировали при 42 ООО g в течение 25 мин в ультрацентрифуге Beckman. После центрифугирования супернатант сливали. Осадок ресуспендировали гомогенизацией в исходном объеме буфера и центрифугировали в тех же условиях. Процедуру отмывки повторяли трижды, полученный осадок ресуспендировали в 20 мл раствора буфера.
Выделение мембранной фракции головного мозга мышей проводили по аналогичной схеме со следующими изменениями: гомогенизацию мозга проводили в 20 мл ледяного TR1S-HC1 буферного раствора. Полученную суспензию центрифугировали при 54000g в течение 25 минут.
Для исследования связывания [1М-метил-3Н]-диазепама мембранную фракцию головного мозга (250 мкл) инкубировали с 50 мкл [М-метил-3Н]-диазепама в конечной концентрации 1 нМ в течение 30 мин при температуре таящего льда (0-4°С) в трех повторах для каждого образца. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого диазепама, растворенного в 5% этаноле до конечной концентрации 10 мкМ для мышей и 20 мкМ для крыс. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим связыванием и неспецифическим связыванием. Объем инкубационной смеси составлял 500 мкл. Реакцию бензодиазепинового связывания останавливали путем добавления ледяного буфера и быстрой вакуумной фильтрации через стекловолоконные фильтры с последующей двукратной промывкой ледяным буфером общим объемом 8 мл. Фильтры высушивали в течение 12 часов при комнатной температуре, затем помещали в сциптилляционную жидкость объемом 5 мл и использовали для сцинтилляционного счета. Радиоактивность проб определяли на счетчике Wallac 1411. Неспецифическое связывание составляло не более 10% от общего. Данные приведены в cpm/мг белка.
Для исследования связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама с мембранами головного мозга в инкубационную среду вносили 250 мкл полученной мембранной фракции, 50 мкл 10 нМ раствора [Ы-метил-3Н]-флунитразепама. Для определения неспецифического связывания вносили 50 мкл раствора 400цМ диазепама в 5% этиловом спирте. Последующая процедура проводилась, как описано выше. Радиоактивность проб определяли на счетчике Beckman после добавления жидкого сциициллята в объеме 3 мл. Данные приведены в dpm/мг белка.
Определение содержания белка в пробах проводили по методу Лоури [ Lowry О.Н., Rosenbrough N.J. , Farr A.R., 1951] с использованием альбумина в качестве стандарта. Оптическую плотность (/.=700 нм) измеряли на спектрофотометре Genesys 10 (THERMO FICHER SCIENTIFIC INC., США).
Для обработки численных данных применена описательная статистика: подсчитаны среднее значение (М), стандартная ошибка среднего (SEM), стандартное отклонение (SD), которые вместе со значением п (количество животных в группе) представлены в итоговых таблицах и рисунках. Межгруниовые различия проанализированы с помощью U-критерия Манн-Уитни. При разделении аутбредных животных использовали метод максимального правдоподобия.
Статистический анализ проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0 (StatSoft, США, номер лицензии: 31415926535897). Различия определяли как статистически значимые при уровне не более 5%.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Фундаментальными исследованиями по генетике поведения доказан наследственный контроль эмоционально-стрессовых реакций (ЭСР) у млекопитающих [Беляев Д.К., 1979; Hall C.S., 1934]. В качестве экспериментальных моделей изучения разных фенотипов ЭСР нами использованы инбредные линии животных противоположные по поведению в тесте ОП: мыши С57В1/6 и Balb/c и крысы MNRA и MR. Как видно из данных таблиц 1 и 2, мыши C57BI/6 и крысы MNRA характеризуются высокой двигательной и исследовательской активностью и незначительным количеством дефекаций. Наоборот, мыши линии Balb/c и крысы MR в ОП демонстрируют реакцию замирания (freezing reaction), выражающуюся в ограниченном числе передвижений и большем уровне дефекаций, что интерпретируется как выраженная реакция страха. Полученные контрольные результаты полностью соответствуют данным литературы и были воспроизведены многократно в ходе дальнейшего выполнения работы [Середенин С.Б., Ведерников A.A., 1979; Seredenin S.B. et al., 1994].
Таблица 1- Поведение мышей линий Balb/c и С57В1/6 в тесте «открытое поле»
Линии ПА ЦА Ц ВА ОДА Количество дефекаций
Balb/c(n=10) 17,5±2,5 0,5±0.4 0,0±0,0 0,0±0,0 19,5±2,5 0,4±0,1
С57В1/6(п=10) 71,8±4,3* 19,0±3,8* 0,9±0,6 11,3±3,5* 110,8±7,2* (),0±0,0
Примечание: данные представлены в виде М±5ЕМ; п — число животных в группе; *, ** — статистически значимое (р<0.05 и р < 0.01) межлинейное отличие согласно и-критерию Манн-Уитни.
Линии ПА ДА ВА ОДА Количество дефекаций
МЯ (п=10) 22,5 ± 2,9 0,4 ± 0,2 4,8 ± 1,2 27,8 ±3,8 4,8 ± 0,5
МЫЯА(п=10) 40,4 ±3,4 ** 3,6 ± 1,2 * 14,4 ± 2,1** 58,5 ±5,8 ** 2,6 ± 0,6
Примечание: как к табл. I
Сравнительная оценка рецепции [Ы-метил-3Н]-диазепама у мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с и крыс МЫЯА и МИ показала, что у интактных животных уровень специфического связывания [М-метил-3! 1]-диазепама синаптосомальной фракцией мозга не отличается. После эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП установлено резкое падение связывания меченного лиганда у мышей Ва1Ь/с, и крыс МЯ, в то время как у мышей С57В1/6 и крыс М^А параметры рецепции не изменились (рис. 1).
Установленные изменения связывающей способности бензодизепинового участка ГАМКд рецептора согласуются с представлениями о закономерностях формирования реакции страха у мышей Ва1Ь/с и крыс МЯ в ОП. Наоборот, для мышей С57В1/6 и крыс МЫЯА обстановка в ОП не является анксиогенной и не вызывала функциональных нарушений в рецепции меченого лиганда.
Шй 26534 .
Ва1Ь/с(п-5) С57В1/6 (п-5) МК(п=7) ММГ!А(п=6) щщщш
после ОП » интактные
О 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 срт/мг белка
Рис. 1. Специфическое связывание []Ч-метил-3Н]—диазепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с, С57В1/6 и крыс МЯ, МЫЛА до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "открытое поле'" (ОП).
Примечание: п-количество животных в группе; *, ** — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05; р<0.01 соответственно) согласно и-критерию Манн-Уитни.
Однако остается неясным, является ли этот признак, специфичным для линий с freezing реакцией в ОГ1, либо данный эффект сопровождает реакцию страха при ее возникновении, вне зависимости от генотипа. Для ответа на этот вопрос исследован уровень специфического связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранной фракцией мозга мышей С57В1/6 и Balb/c после стрессового воздействия в различных тестах; ОП, ПКЛ, «кратковременной иммобилизации» (Им) и «контакт с хищником» (КХ).
Повторный анализ поведения мышей C57BI/6 и Balb/c в тесте ОП, подтвердил установленные ранее закономерности межлинейных различий их эмоционально-стрессовой реакции по критерию двигательной активности (табл. 3). Также, как при использовании в качестве лиганда [Г4-метил-3Н]-диазепама в ОГ1 наблюдали значительное падение специфического связывания [Ы-метил-'] 1|-флунитразепама мембранами мозга мышей Balb/c, в то время как у C57BI/6 параметры рецепции не менялись (рис.2).
Таблица 3 -Поведение мышей линий Baib/c и С57В1/6 в тесте ОП
Линия Виды двигательной активности Кол-во дефекаций
Периферическая активность Центральная активность Центр Вертикальная активность Общая двигательная активность
Balb/c п=10 13,4±1,7 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 13,4±1,7 0,6±0,2
С57В1/6 п=10 66,5±5,4* 24,4±2,3* 2,0±0,5* 14,6±1,6* 107,5±7,9* 1,5±0,5
Примечание: как к табл. 1
Рис. 2. Специфическое связывание [Ы-метил-" 11]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до п после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП. Примечание:
* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05) согласно и-критерию Мани-Уитни.
Анализ поведения мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте ПКЛ выявил выраженные межлинейные различия по показателям двигательной активности и времени нахождения в закрытых рукавах лабиринта, так мыши Ва1Ь/с проводили в два раза
5 8000-
6000Л 40005
о 2000Н
интактные ОП
интактные ОП
C57BI/6
больше времени в закрытых рукавах и в два раза реже меняли рукава лабиринта, чем мыши линии С57В1/6 (табл. 4).
Таблица 4 - Поведение мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6 в тесте ПКЛ
Линия % нахождения в открытых рукавах % нахождения в закрытых рукавах Двигательная активность,
Ва1Ь/с п=8 12,13+3,54 44,04+6,11* 3,88+0,30*
С 57В1/6 п=8 7,29+3,06 23,88+4,04 9,13+0,55
Примечание: как к табл. 1
Пятиминутная экспозиция мышей линии Ва1Ь/с в ПКЛ статистически значимо снижала уровень специфического связывания ["Ы-метил-3Н|-флунитразепама, в то время как у С57В1/6 параметры рецепции не менялись (рис. 3). Учитывая, что тесты ОП и ПКЛ имеют в качестве основного стрессирующего фактора новую обстановку, сходство полученных результатов можно считать закономерным.
Рис. 3. Специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва!Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте ПКЛ. Примечание:
* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05) согласно и-критерию Манн-Уитни.
Для моделирования более выраженного анксиогенеза отобраны тесты «кратковременная иммобилизация» (Им) и «контакт с хищником» (КХ).
Полное лишение подвижности мышей на 90 минут привело к значимому снижению бензодиазепинового связывания как у мышей Ва1Ь/с, так и С57В1/6 (рис.4).
В следующей серии экспериментов оценивали влияние анксиогенной обстановки, вызванной присутствием природного хищника - домашней кошки на уровень специфического связывания меченого флунитразепама мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6.
6000-
* 4000-1 2
^ 2000-
4710 4441
интактные ПКЛ
интактные ПКЛ
С57В1/6
g 6000-<8
^ 4000-Е
о 2000-
О 3452*
C57BI/6
Рис. 4. Специфическое связывание [1М-метнл-3!!]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "иммобилизация" (Им). Примечание:
* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).
Интактные Им
Интактные Им
Визуальные наблюдения за поведением мышей в тесте с «контакт с хищником» показали, что в контрольной группе, в отсутствии хищника. - животные свободно перемещались по всей площадке плексиглазового короба с характерными проявлениями исследовательской активности, более выраженной у мышей С57В1/6.
В опытной группе как у мышей Ва1Ь/с, так и у С57В1/6 наблюдались этологически значимые проявления тревоги и страха. В присутствии хищника двигательная активность мышей Ва1Ь/с снижалась, отмечались длительные реакции замирания, животные часто принимали распростертые позы, закапывались в опилки. У мышей линии С57ВІ/6 значительно снижалась исследовательская активность, короткие реакции замирания чередовались с активно защитной формой поведения -побегом на противоположную от хищника сторону клетки. Полученные данные соответствуют результатам работ, выполненных сходными методами [Яос^егв Ги, et аі., 1997].
4000-
2000'
Рис. 5. Специфическое связывание [N1-метил- Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р|+Р2) головного мозга мышеи линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "Контакт с хищником" (КХ). * — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).
контроль КХ
контроль КХ
C57BI/6
В результате исследования связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранами мозга мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте КХ показано, что при сходстве контрольных параметров рецепции контакт с хищником приводил к падению
связывания лиганда как у мышей Ва1Ь/с, так у С57В1/6, несколько более выраженному у Ва1Ь/с (рис. 5).
Результаты, демонстрирующие падение рецепции [1М-метил-3Н]-флунитразепама у мышей обеих исследованных линий в тестах Им и КХ, в отличие от ОП и ПКЛ, в которых данный эффект установлен только у мышей линии Ва1Ь/с, позволяют заключить, что генетические различия в стрессиндуцированом падении связывающей способности бензодиазепинового участка ГАМКд рецептора зависят от силы стрессирующего фактора, иными словами генотип определяет уровень стрессустойчивости, однако, при возникновении реакции страха нейрохимические сдвиги ее сопровождающие оказываются сходными.
Для оценки специфичности функциональных изменений Г'АМКд рецептора для анксиогенеза бензодиазепиновая рецепция была изучена в тестах моделирующих депрессивное состояние - «вынужденное плавание» (ВП) и болевое воздействие -«горячая пластинка» (ГП).
С57ВІ/6
Интактные ВП 5 мин
Интактные ВП 5 мин
міиїтииитятиіпгшмям пецнфическое связывание рч-
мегил-^Н]—флунитразепама
мембранной фракцией (Р1+Р2)
головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и
С57В1/6 до и после эмоционально-
стрессового воздействия в тесте
"вынужденное плавание" (ВП 5 мин).
С57ВІ/6
Интактные ВП Интактные ВП
15 мин 15 мин
МННШМИНМНШНММШ:: 7. Специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте '"вынужденное плавание" (ВП 15 мин).
Полагая, что развитие депрессивного состояния у мышей в тесте ВП проходит через стадию повышения тревожности были проведены эксперименты с различной продолжительностью воздействия 5 и 15 минут. Однако, в исследованных интервалах времени сдвигов в бензодиазепиновой рецепции обнаружено не было, что свидетельствует в пользу сопряжения феномена стресс-индуцированного падения бензодиазепинового связывания с реакцией страха, а не с состоянием, моделируемым в тесте ВП (рис. 6 и 7). Полученные данные соответствуют результатам клинических
исследований, не выявивших у больных с депрессией изменений бензодиазепинового связывания [Stocks GM, et al., 1990; Kugaya A. et al, 2003; Merali Z., et al., 2004; Rochet Т. et al., 1992; Zhu H. et al., 2006].
ГП - стандартный тест для изучения болевой чувствительности грызунов, оценивает болевой рефлекс при контакте подушечек лап с горячей поверхностью [Eddy NB and Leimbach D , 1953]. Острое ноцицентивное раздражение в тесте ГП не вызывало снижения бензодиазепиновой рецепции, и наоборот приводило к значительному подъему уровня в сравнении с интактной группой у обеих линий мышей (рис.8). Увеличение бензодиазепиновой рецепции в тесте «горячая пластинка» однозначно соотносится с представлениями об активации ГАМК трансмиссии при болевом воздействии, как элемента эндогенной системы антиноциценции [Наша А.Т., Borsook D., 2005; Mhler Н. et al., 2004; Enna SJ, McCarson KE„ 2006; Rudolph U, Knoflach F., 2011].
Интактные
C57BI/6 Интактные FrT
Рис. 8. Специфическое связывание [Ы-метил-'Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 до и после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "горячая пластинка" (ГП).
* — статистически значимое отличие по сравнению с группой интактные (р<0.05).
Обобщая результаты данного этапа работы, можно заключить, что феномен падения бензодиазепиновой рецепции специфичен для тревожных состояний, и, что наследственные различия в сгрессустойчивости так же могут быть типированы по снижению связывающей способности бензодиазепинового сайта ГАМКд рецептора. Данное заключение дополнено анализом продолжительности изменений в бензодиазепиновой рецепции при различных по силе стрессовых воздействиях для разных фенотипов стрессового ответа. Проведено исследование временных характеристик падения бензодиазепиновой рецепции у мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с после экспериментов в тестах ОП и КХ.
Статистически значимое снижение специфического связывания меченого флунитразепама у мышей Ва1Ь/с после трехминутной экспозиции в ОП, в сравнении с интактным контролем, установлено для временного интервала 0-90 минут (табл. 5).
Анксиогенная обстановка в присутствии хищника привела к снижению рецепции как у мышей Ва1Ь/с, гак и у С57В1/6 которое сохранялось у Ва1Ь/с в течение восьми часов, а у С57В1/6 - на протяжении 24 часов (табл. 6).
Таблица 5 - Продолжительность изменений уровня специфического связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранной фракцией (Р]+Р>) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с после стресса в тесте ОП.
Линии Контроль Время после стресса в тесте «открытое поле», мин
0 60 90 120 150
Balb/c 4250(94) n=4 3607(125) п=4 2654(563) п=4 3523(247) п=4 4594(782) п=4 4127(193) п=4
Р р<0.05 р<0.05 р<0.05
Примечание: данные представлены в виде М(БО); п-колнчество животных в группе' р- статистически значимое отличие уровня рецепции по сравнению с контрольной группой согласно и критерию Манн-Уитни
Таблица 6 - Продолжительность изменений уровня специфического связывания [Ы-метил-3Н]-флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2)головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6 после стресса в тесте «контакт с хищником»
Контроль Время после стресса в тесте «контакт с хищником», часы
0 8 16 24 32
Balb/c 4353(663) 3144(744) 3029(369) 3536(1251) 4585(156) 4323(327)
п=6 п=4 п=4 п=4 п=4 п=4
Р р<0.05 р<0.05
С57В1/6 5310(404) 4351(325) 3587(282) 3341(498) 3287(304) 4630(493)
п=4 п=4 п=4 п=4 п=4 п=4
Р р<0.05 р<0.05 р<0.05 р<0.05
Примечание: как к таблице 5
Установленные нами данные о временных характеристиках межлинейных различий в бензодиазепиновой рецепции соответствуют литературным сведениям по другим параметрам оценки реакции на стресс у инбредных животных с разной стрессустойчивостыо. Временные межлинейные различия выявлены В Р" норадренергической, глутаматной, глюкокортикоидной и минералкортикоидной рецепторных системах [Blundell J. et al„ 2005; Adamec R et al., 2010; Adamec R. et al., 2007], в изменениях 5-HT1A, 5-HT2A и CRFi рецепторов [Adamec R. et al., 2004; Adamec R. et al., 2010]. Длительные сдвиги возникают в уровне экспрессии белков нейрональной пластичности, например вызванное присутствием хищника увеличение экспрессии pCREB в различных регионах мозга (от 6 часов до 7 дней после стресса) [Adamec R., Hebert М., Blundell J., 2011; Adamec R. et al. 2006]. Получены данные об
активации экспрессии cFos в префронталыюй коре и амигдале у крыс через два часа после предъявления хищника [Adamec R. et al., 2012]. Важно, что указанные изменения также различались у высоко- и низкотревожных крыс [Adamec R. et al., 2010].
Таким образом, констатируя наличие временных различий в нейрохимических изменениях у инбредных животных с разными фенотипами стрессового ответа, включая установленные нами функциональные сдвиги, возникающие в короткие сроки в ГАМКд рецепторе, можно полагать, что данные параметры дополняя представления о патогенетических механизмах формирования тревоги могут быть полезными для диагностики состояния и оценки эффективности фармакотерапии.
Следующий этап работы был посвящен изучению влияния на бензодиазепиновую рецепцию фармакологически индуцированного анксиогенеза.
Использованы три апксиогенных соединения, воздействующих на различные нейромедиаторные системы: производное p-карболинов - соединение р-ССВ, йохимбин и кофеин.
Бета-карболины, являясь функционально неоднородной группой лигандов бензодиазепинового рецептора, рассматриваются в ряде работ как эндогенные лиганды и функционально проявляют свойства обратных агонисгов бензодиазепинового участка ГАМКа рецептора, вызывая аиксиогенез у лабораторных крыс н мышей в диапазоне доз 1-30 мг/кг [Novas ML, ct al., 1988; Hindley SW, et al., 1985; File SE, Pellow S. ,1984] н обезьян [Ninan PT, et al., 1982; Crawley JN, et al., 1985]. Анксиогенная активность p-карболинов, подтверждается наблюдениями на людях [Skolnick Р, et al., 1984; DukaT, et al., 1988; Dorovv R, et al.,1987],
В настоящем эксперименте использовалось внутрибрюшинное введение р-ССВ инбредпым мышам в дозе 3,0 мг/кг за полчаса до тестирования в ПКЛ или декапитации, при определении уровня бензодиазепинового связывания.
Р-ССВ, вызывал выраженный анксиогенный эффект как у мышей линии Balb/c, так и С57В1/6. У мышей линии Balb/c снижение двигательной активности сопровождалось сокращением времени проведенного в рукавах лабиринта за счет нахождения на центральной площадке, у мышей линии С57В1/6 значимым сокращением пребывания в открытых рукавах лабиринта (табл. 7).
Таблица 7 - Влияние р-ССВ на поведение мышей линии С57В1/6 и Balb/c в тесте ПКЛ
Линия Препарат Время в рукавах лабиринта, сек Двигательная активность (число заходов в рукава)
открытые закрытые центр открытые закрытые
Balb/c КИ п=8 31,0±4.43 163,2,0±12,9 105,7±11,9 3,5±0,2 4,6±0,6
р-ссв (3,0мг/кг) п=8 16,5±5,8 99,4±22,9 р<0.05 184,1±22,2 р<0.05 1,6±0,6 р<0.05 4,7±0,7
С57В1/6 КИ п=8 52,7±9,4 162,1±20,4 85,1±13,6 3,0±0,4 6,1 ±0,4
р-ссв (3,0мг/кг) п=8 15,6±2,1 р<0.01 196,5±10,1 87,8±11,0 1,7±0,2 р<0.»5 5,4±0,3 р<0.05
Примечание: данные представлены в виде М±8ЕМ; п-количество животных в группе; р — статистически значимое отличие от группы «контрольная инъекция» (КИ) согласно и критерию Манн-Уитни
Рис. 8. Влияние соединения р-ССВ в дозе 3,0 мг/кг на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р]+Р>) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контрольная инъекция (КИ) (р<0.05).
Анализ связывания [ Ы-метил-3Н|-флунитразепама мембранами мозга мышей линий Balb/c и С57В1/6, которым за 30 мин до декапитации в/бр ввели Р-ССВ в дозе 3,0 мг/кг показал значимое снижение (на 40%) бензодиазепиновой рецепции у мышей обеих линий (рис.8).
Анксиогенвый эффект Д-карболинов обусловлен изменением функционального состояния ГАМКд рецептора. Однако первичные механизмы анксиолитического действия бензодиазепинов и анксиогенных эффектов p-карболинов, по-видимому, не идентичны, поскольку точкой приложения p-карболинов в ГАМКд рецепторном комплексе является р субъединица, пары «р [von Blankenfeld О. et al., 1990; Kleingoor С. et al., 199; Stevenson A. et al., 1995; Sieghart W., 2006], a беызодиазепины
g 60005
•о 2000-
C57B1/6
(3-CCB (3 мг/кг)
(3 мг/кг)
взаимодействуют на границе пары иу [Sieghart W. et al., 2011]. Известно, что -карболины концентрационно зависимо ингибируют специфическое связывание 35S-TBPS, что свидетельствует о реализации их анксиогенпого эффекта изменением функционального состояния С1-ионофора. Являясь негативными аллостерическими модуляторами -карболины препятствуют входящему току хлора и вызывают анксиогенный эффект. [Stephens DN, Shearman GT, Kehr W., 1984; Stephens DN. et al., 1984]. Учитывая взаимосвязь рецепции в бензодиазепиновом сайте, ГАМК и транспорта СГ, установленный нами эффект может быть опосредован снижением входа СГ в клетку.
Следующее изученное соединение йохимбин обладает высокой аффинностью к аг-адренорецепторам, проявляет умеренное сродство к ai-адренорецепторам, 5-НТ1В, 5-НТщ, 5-HTif, 5-НТ2В и D2 рецепторам и является частичным агонистом 5-НТ1А рецепторов [Millan M J, et al., 2000; Johnston AL, File SE. , 1989; Cheng CH, et al., 1993], вызывает состояние страха и тревоги как у людей [Cameron OG, et al., 2000], так и животных (Braun АА, et al., 2011), при этом его анксиогенное действие не связано непосредственно с ГАМКд рецепторами [Pellow S, Chopin Р, File SE., 1985].
Йохимбин, введенный внутрибрюшинно в дозе 5,0 мг/кг за 30 мин до эксперимента в ОП угнетал все виды двигательной активности мышей как линии Balb/c, так и линии С57В1/6, вызывая выраженную freezing реакцию (табл. 8).
Таблица 8 - Влияние йохимбина на поведение мышей линии С57В1/6 и Balb/c в тесте ОП
Линия Препарат ПА ЦА Ц ВА ОДА Деф
Balb/c КИ п=10 13,4 ±1,7 0,0±0,0 0,0±0.0 0,0 ±0,0 13,4±1,7 0,6±0,2
йохимбин (5,0мг/кг) п=10 1,9±0,6 pcO.OOOl 0,5±0,3 0,0±0,() 0,0±0,0 2,4±0,7 р<0.0001 0,1 ±0,1
С57В1/6 КИ п=10 66,5±5,4 24,4±2,3 2,0± 0,5 14,6 ±1,6 107,5±7,9 1,5±0,5
йохимбин (5,0мг/кг) п=10 3,6± 1,4 р<0.0001 1,1 ±0,9 р<0.0001 0,0± 0,0 р<0.05 0,0±0,0 р<0.0001 4,7±2,3 р<0.0001 0,2±0,1
Примечание: как в таблице 7.
Анксиогенный эффект йохимбина по-разному проявлялся у мышей исследуемых линий в тесте ПКЛ. На фоне снижения двигательной активности животные линии Ва1Ь/с отдавали предпочтение закрытым рукавам лабиринта в
сравнении с контрольной группой. У мышей С57В1/6 статистически значимо снижалась количество смен рукавов (табл. 9).
Предварительное введение йохимбина за 30 мин до декапитации приводило к нарушению специфического связывания меченого лиганда мембранной фракцией головного мозга как мышей Ва1Ь/с, так и мышей С57В1/6 (рис.9).
Таблица 9 - Влияние йохимбина на поведение мышей линии С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте ПКЛ
Линия Препарат Время в рукавах лабиринта, сек Двигательная активность (число заходов в рукава)
открытые закрытые центр открытые закрытые
Ва1Ь/с КИ 11=8 80,0±20,8 92,0±21,6 128,0±22,1 3,5±0,6 3,0±0,5
йохимбин (5,0мг/кг) п=8 2,3±Т,2 р<0.001 240,1±8,5 р<0.001 58,5±7,7 р<0.05 0,5±0,3 р<0.001 2,8±0,3
С57В1/6 КИ п=8 46,9±9,9 173,8±14,3 80,6±7,1 4,0±0,4 7,б±0,9
йохимбин (5,0мг/кг) п=8 33,0±8,3 183,5±17,9 83.5±15,2 1,7±0,5 р<0.05 3,1±0,4 р<0.001
Примечание: как в таблице 7.
* 6000-
^ 4000-
т> 2000-
С57ВІ/6
Йохимбин (5,0 мг/кг)
Рис. 9. Влияние йохимбина в дозе 5,0 мг/кг на специфическое связывание метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контрольная инъекция (КИ) (р<0.05).
Йохимбин (5,0 мг/кг)
Таким образом, анксиогенный агент йохимбин, не являясь лигандом к ГАМКа рецептору, вызывал изменения связывающей способности бензодиазепинового сайта аналогично наблюдаемым при воздействии других факторов, индуцирующих тревожность.
В основе психостимулирующего действия кофеина лежит его способность подавлять активность центральных аденозиновых рецепторов (А| и А2) в коре
головного мозга и подкорковых образованиях ЦНС [Fcnc S. , 2010; Lopes LV, Sebastiao AM, Ribeiro JA. , 2011]. Психофармакологические эффекты кофеина в существенно» мере зависят от дозы препарата. Доказано, что в малых и средних дозах кофеин оказывает возбуждающее, а в больших дозах - угнетающее действие на функциональную активность ЦНС, включая усиление тревожности [Hughes R., 1996; Bhattacharya SK, Satyan KS, Chakrabarti A. , 1997; Childs E, et al., 2008]. Кофеин не обладает избирательной способностью блокировать только А|-аденозиновые рецепторы головного мозга. Он может блокировать и А2-аденозиновые рецепторы, что в свою очередь способствует усилению функциональной активности D;-дофаминовых рецепторов [Baldwin НА, File SE. , 1989; Fuxe К, et al., 2005] и как следствие приводит к анксиогенезу [de la Mora MP, et al., 2010; de Oliveira AR, Reimer AE, Brandao ML., 2006].
Для моделирования анксиогенного состояния в настоящем исследовании использовалась высокая доза кофеина 100,0 мг/кг. Препарат вводили интрагастрально за 60 мин до тестирования в ОН и I1КЛ, или декапитации.
В тестах ОП и ПКЛ кофеин вызывал выраженный анксиогенсз, значимо угнетая двигательную активность обеих линий мышей (табл. 10 и 11).
Анализ функционального состояния бензодиазенинового участка ГАМКд рецептора показал значительное снижение связывания меченого флунитразепама синаптосомами головного мозга мышей обеих линий, на фоне премедикации кофеином в сравнении с группой «контрольная инъекция» (рис.10).
Таблица 10 - Влияние кофеина на поведение мышей линии С57В1/6 и Balb/c в тесте ОП
Линия Препарат ПА ЦА Ц ВА ОДА Деф
Balb/c КИ п=8 16,1±|,5 0,7± 0,3 0,0±0,0 0,0± 0,0 16,9± 1,6 0,7±0,3
кофеин (1 ОО.Омг/кг) п=8 5,8±2,2 р<0.05 0,0± 0.0 0,0± 0,0 0,0± 0,0 5,6± 2,2 р<0.05 0,5±0,2
С57В1/6 КИ п=8 б 1,1 ±3,6 19,6±2.9 0,5±0,3 11,0±1,4 92,3±5,5 0,4±0,2
кофеин (100,0мг/кг) п=8 12,4±4,4 р<0.0001 20.9±7,6 0,9±0,4 0,0± 0,0 р<0.0001 34,1±11,9 р<0.001 0,0±0,0
Примечание: как в таблице 7.
Таблица 1 I - Влияние кофеина на поведение мышей линии С57В1/6 и Ва1Ь/с в тесте Г1КЛ
Линия Препарат Время в рукавах лабиринта, сек Двигательная активность (число заходов в рукава)
открытые закрытые центр открытые закрытые
Ва1Ь/с КИ п=8 31,0±4,4 163,3±12,9 105,8±11,9 3,3±0,3 4,5±0,7
кофеин (100,0мг/кг) п=8 3,8±2,2 р<0.0001 218,8±5,0 р<0.05 77,5±5,8 р<0.05 0,4±0,2 р<0.0001 1,5±0,2 р<0.05
С57В1/6 КИ п=8 14,1 ±7,4 172,8±9,1 113,1±П,1 1,1 ±0,5 6,8±0,7
кофеин (100,0мг/кг) п=8 2,6±1,7 214,1±7,9 р<0.05 83,3±6,9 р<0.05 0,4±0,3 10,8±1,1 р<0.05
Примечание: как в таблице 7.
Рис. 10. Влияние кофеина в дозе 100,0 мг/кг на специфическое связывание [14-метил- Н]—флунитразепама мембранной фракцией (Р1+Р2) головного мозга мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6. * — статистически значимое отличие по сравнению с группой контрольная инъекция (КИ) (р<0.05).
о-1-1-1-1-1-1-
КИ Кофеин КИ Кофеин {100,0 мг/кг) (100,0 мг/кг)
Таким образом, применение трех различных по механизму действия анксиогенов, привело к сходным результатам - формированию реакции страха и падению бензодиазепиновой рецепции вне зависимости от генотипа изученных животных.
Следовательно, можно заключить, что и в случае фармакологически индуцированного анксиогенеза феномен падения бензодиазепиновой рецепции имеет маркерное значение.
Полученные данные о сопряжении тревоги с падением рецепции в бензодиазепиновом участке и возникновении этого эффекта в зависимости от силы стрессируюшего фактора, определили постановку следующей задачи. А именно, изучение изменений бензодиазепиновой рецепции при введении разных по структуре и механизму действия анксиолитиков для выяснения ранее поставленного вопроса,
50004000300020001000-
С57ВІ/6
может ли данный параметр иметь маркерную значимость для анксиолитического эффекта.
Исследовали разработанные в ФГ'БУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН препараты: афобазол - производное 2-меркаптобензимидазола, новый оригинальный анксиолитик; МП - основной метаболит афобазола; ноопепт -новый оригинальный препарат усиливающий когнитивные функции при их нарушении, обладающий анксиолитическими свойствами; ладастен - производное адамантана. новый оригинальный препарат в спектре психофармакологического действия которого установлены психостимулирующий и анксиолитический эффекты; ГБ-115 - соединение пептидной природы, взаимодействующее с холицистокининовыми I типа, бомбезииовыми и каппа опиоидными рецепторами, обладающее выраженными противотревожпыми свойствами. Все соединения относятся к разным химическим группам. В радиолигандных исследованиях совместно с компанией СЕЯЕР (Франция) установлено, что они не являются лигандами ГАМКа рецептора. Анксиолитические свойства препаратов продемонстрированы в собственных экспериментах с применением стандартных методов. В качестве референтного препарата использован диазепам.
Исследование выполнено по следующему протоколу: предварительное введение соединений мышам С57В1/6 и Ва1Ь/с, оценка их поведения в тестах ОН, ПКЛ и Г<Х, определение уровня специфического связывания |ТМ-метил-3Н]-флупитразепама синаптосомальными мембранами мозга. Параллельно изучали влияние препаратов на бензодиазепиновую рецепцию вне стрессового воздействия.
Предварительное введение афобазола в дозе 1,0 мг/кг, ноопепта в дозе 1,5 мг/кг, ладастена в дозе 50,0 мг/кг, ГБ-115 в дозе 0,025 мг/кг значимо увеличивало двигательную активность в тесте ОП у мышей линии Ва1Ь/с и предотвращало наблюдаемое в тесте падение бензодиазенинового связывания. Поведение мышей С57В1/6 и уровень специфического связывания радиолиганда после эксперимента в ОП не изменялись (рис. 11, рис. 12).
В тесте ПКЛ соединения вызывали аиксиолитическое действие и также предотвращали падение связывания радиолиганда только у мышей линии Ва1Ь/с (рис.13, рис. 14).
i КИ Препарат
44,4**"
Ношепт Ладастен
30,2"' Ш 07.5,04,6
11
9,1 11 я
1 11 я
ГБ-115 Диазепам Афобэзол
C57BI/6
в КИ * Препарат
134 115,2
Ноопепг Ладастен ГБ-115 Диазепам
Рис.11 Влияние анксиолитиков на уровень «общей двигательной активности» мышей линий Balb/c и С57В1/6 в тесте «открытое поле»
Примечание: количество животных в группе=8; —статистически значимые (р<0.05;
р<0.01; р<0.001) отличия от группы «контрольная инъекция»(КИ) согласно U критерию Манн-Уитни.
5157(5571* 5287(10491* -ЧЗ)"
5265(8431*_
4192(8495*
Диазепам 1,0 мг/кг + ff|
ГБ-115 0,025 мг/кг +ОП |
Ладастен 50,0 мг/кг + ОгГ
.............Ноопепг 1,5 мг/кг + оп]
Афобаэол 1,0 мг/кг 4- ОН 3155(614) Контрольная инъекция -ЮП[
4847(7841
Диазепам 1,0 мг/кг + рП |
4661(4511 0 1000
Контрольная инъекция -ЮП 2000 3000 4000 5000
Рис. 12. Влияние препаратов на специфическое связывание [Ы-метил-3Н]—флунитразепама мембранной фракцией (P|+Pi) головного мозга мышей линии Balb/c и С57В1/6 после эмоционально-стрессового воздействия в тесте "открытое поле".
Примечание: абсцисса — dpm/мг белка — радиоактивный распад за минуту на мг белка; данные представлены в виде M(SD); количество животных в каждой группе 8; *-статистически значимое отличие по сравнению с группой «контрольная инъекция+ОП» (р<0.05).
Предварительное введение афобазола, ноопепта, ладастена и ГБ-115 в анксиолитических дозах с последующим стрессированием мышей в тесте КХ предотвращало стрессиндуцированное падение бензодиазепиновой рецепции как у мышей линии Balb/c, так и С57В1/6 (рис. 15).
Визуальные наблюдения за поведением мышей в тесте с КХ показали, что в отличие от группы «контрольная инъекция» в опытных группах мышей обеих линий, которым предварительно были введены анксиолитики, животные свободно
% времени в открытых рукавах
КИ ® Препарат
Двигательная активность
«КИ в Препарат
С57В1/6
% времени в открытых рунаеах Двигательная активность
жКИ Препарат т КИ Препарат
Рис. 13 - Влияние анксиолитиков на поведение мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6 в гесте ПКЛ. Примечание: количество животных в группе-8; *,**— статистически значимые (р<0.05: рсО.ОП отличия от гру
